一. 原位雜交天
1. 重新水化和固定
1) 吸取固定好的胚胎,加入50%的PBST溶液,放置5分鐘。
2) 置換成30%的PBST溶液,放置5分鐘
3) 置換成PBST溶液,放置5分鐘,重復一次
4) 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5) 用PBST洗兩次,每次放置五分鐘,室溫。
蛋白酶處理與后固定(本實驗不做此步)
1) 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理,5體節(jié)到24小時的胚胎處理3分鐘,24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發(fā)育時間越短的胚胎越嫩,可以不用或者少用蛋白酶處理,發(fā)育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松組織,以便于雜交。
2) 用PBST溶液輕洗,在PBST中放置5分鐘。
3) 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘,室溫。
4) 用PBST洗兩次,每次放置五分鐘,室溫。
熒光原位雜交(FISH)技術(shù)具有以下優(yōu)點:
可多重染色:利用不同的熒光染料標記不同的探針,GISH,可以實現(xiàn)多重熒光原位雜交,從而同時檢測多個序列,提高實驗效率了。
高度創(chuàng)新性和性:FISH技術(shù)不僅可以用于研究已知基因或序列的染色體定位,還可以用于未基因或遺傳標記及染色體畸變的研究,在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優(yōu)勢。
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