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主營：原位雜交,亞細(xì)胞定位,蛋白互作,啟動(dòng)子篩選
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| 先生： |
為什么有的基因定位結(jié)果與預(yù)想的不一致？
對于一個(gè)特定的定位載體，只要熒光表達(dá)較好，BIFC，其定位結(jié)果是確定的，不會(huì)隨人為意愿或操作而改變。至于有時(shí)候和預(yù)想的結(jié)果不一樣，可能和蛋白本身、選擇的表達(dá)載體以及熒光蛋白融合方式等有關(guān)。
為什么有的普通定位結(jié)果出來后無法準(zhǔn)確判斷其定位位置？
細(xì)胞中的細(xì)胞器復(fù)雜且多樣，除一些常見的、特征比較明顯的細(xì)胞器外，有些細(xì)胞器在激光共聚焦下形狀比較相似，例如：線粒體、過氧化物酶體、高爾基體等細(xì)胞器，它們的熒光表達(dá)形狀可能都是點(diǎn)狀，因此不易區(qū)分。這時(shí)可以結(jié)合基因的其他功能研究來判斷其可能表達(dá)的位置。另外，蛋白表達(dá)本身也是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多個(gè)合成場所及轉(zhuǎn)運(yùn)過程，自身表達(dá)情況可能比較復(fù)雜，因此不易判斷具體的表達(dá)位置。
為什么不先對一個(gè)基因做預(yù)測，在預(yù)測的結(jié)果上直接做共定位？
不同的預(yù)測網(wǎng)站有不同的計(jì)算方法，同一個(gè)基因在不同的預(yù)測網(wǎng)站也可能得出不同的定位結(jié)果。另外所有的結(jié)果都應(yīng)是基于實(shí)驗(yàn)得到的，對于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推薦先做普通定位，根據(jù)普通定位的結(jié)果再?zèng)Q定做哪種細(xì)胞器的共定位。
為什么有的基因做原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時(shí)熒光蛋白不亮？
不同物種的細(xì)胞可能對基因表達(dá)有影響，當(dāng)在一種材料的原生質(zhì)體中觀察不到熒光時(shí)，可以考慮換一種受體材料。另外，如果是分泌蛋白，在原生質(zhì)體中無法觀察到熒光，此時(shí)可以考慮注射葉片來觀察熒光。
拍攝時(shí)為什么有明場通道？
（1）顯示細(xì)胞狀態(tài)，有活力的原生質(zhì)體細(xì)胞應(yīng)該是飽滿圓潤的，變形或破碎的細(xì)胞說明此時(shí)細(xì)胞不是適狀態(tài)或細(xì)胞已。
（2）顯示熒光確實(shí)是細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的，而不是細(xì)胞碎片及雜質(zhì)產(chǎn)生的雜光。
構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體時(shí)，GFP融合位置為什么有N端、C端之分？
若序列中存在信號肽，則構(gòu)建載體時(shí)需避開這一端來融合熒光蛋白。需注意不同的融合方式可能會(huì)得到不同的定位結(jié)果，例如融合在熒光蛋白N端的目標(biāo)蛋白一般無法得到過氧化物酶體的定位結(jié)果；融合在熒光蛋白C端的目標(biāo)蛋白一般無法得到線粒體、質(zhì)體的定位結(jié)果。
為什么不同的受體材料有時(shí)得到的定位結(jié)果不一樣？
不同物種的細(xì)胞在翻譯表達(dá)基因時(shí)，其表達(dá)模式和影響因子不同。受物種差異的影響，同一個(gè)載體在不同的受體材料中表達(dá)的位置可能不同，因此建議實(shí)驗(yàn)時(shí)盡可能選用與目的基因來源相近的受體材料進(jìn)行表達(dá)。
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